这是他在辽东军事行动中首次留下明确记载的战绩，也为后续参与抗金埋下伏笔。
万历四十七年，后金汗努尔哈赤以“七大恨”告天，正式起兵反明。
攻陷抚顺、清河等地，辽东战局骤然紧张。明廷派杨镐为辽东经略，调集大军应对，毛文龙因之前在辽东的军事经验，获加衔“都司”，编入抗金序列。
翌年，萨尔浒之战爆发，明军四路出兵却惨遭大败，损失兵力四万余人，后金乘胜攻陷开原、铁岭，辽东东部防线彻底崩溃，明廷被迫启用熊廷弼为辽东经略，重整辽东防务。
熊廷弼到任后，推行“三方布置”战略，以辽东陆路为主体，登莱、天津水师为两翼，相互策应。
毛文龙被编入沈阳游击柏世爵麾下，驻守沈阳，负责“施放毒药以防备后金”，同时管辖铁骑营，在宽奠、叆阳一带设防。
这段经历让毛文龙对辽东东部山区的地形、关隘了如指掌，为他后续开展游击作战积累了关键地理信息。
泰昌元年十月，熊廷弼因朝廷党争去职，离任前专门上疏表彰诸将功劳，为毛文龙请授“实授都司衔”，肯定其防务贡献。
就在熊廷弼去职前十天，毛文龙在杏山寨击退来犯敌兵（推测为趁火打劫的蒙古部落），“亲斩级一颗，部下斩级二颗”，这是他抗金生涯中首次有明确记录的战功，初步展现出实战能力。
熊廷弼去职后，袁应泰接任辽东经略。
袁应泰虽有治政之才，却缺乏军事经验，上任后更改熊廷弼防御策略，放松对后金的警惕。
天启元年三月，后金大举进攻辽东，辽阳、沈阳相继陷落，袁应泰自焚殉国，辽东巡抚薛国用等人出逃，辽河以东诸城尽归后金所有。
毛文龙在鞍山堡的亲属及家丁毛文仪等一百余名老幼被后金擒杀，另有三百余名亲属家丁从辽阳逃至辽西广宁右屯卫，家族遭遇重创。
辽阳陷落后，毛文龙“遭逢不偶，落魄二十余年”的感慨再度涌上心头，眼看封侯之志即将破灭，心灰意冷下决意南返，为母亲养老送终。
然而，命运的转折再次出现——他在南返途中偶遇蓟辽总督文球。
得知新任辽东巡抚（广宁巡抚）王化贞正在广宁访求武才，重振旗鼓的毛文龙当即改变主意，主动自荐并前往广宁谒见王化贞。
王化贞正急于组建抗金力量，见毛文龙熟悉辽东地形、且有实战经验，便委任其为“练兵游击”（另有一说称，时任山东左布政使的沈光祚与王化贞友善，暗中举荐毛文龙，促成此次任用）。
天启元年（1621年）五月，王化贞命毛文龙深入辽东沦陷区，伺机夺取鸭绿江口的镇江堡（今辽宁丹东）——此地是后金连接朝鲜的交通要道，战略位置重要。
五月二十日，毛文龙率领仅有的197名官兵，乘坐4艘沙船从海上出发，沿辽东半岛海岸航行两个月，避开后金主力，秘密开展战前准备：一方面联络降金汉将杨于渭、单尽忠、刘爱塔等人，策反其反正；
另一方面在辽东沿海诸岛安抚流民，收拢失散明军，“收服一千四百人以上”；
同时擒获哈店岛守将任光先、石城岛守将何国用等十人及买牛的女真人二十名，斩获首级三颗，俘获后金船只三只、铜炮二位、铁炮四位，初步建立起敌后作战基础。
七月十八日，毛文龙率部抵达朝鲜龙川郡弥串堡，与刚从朝鲜求援归来的辽东生员王一宁会合，共同策划奇袭行动。
他们通过当地民众得知，后金镇江游击佟养真已派一千余名女真兵前往双山救援被袭的后金将领缪一真，镇江城内兵力空虚，仅余不满千人。
七月十九日，镇江住民徐六向毛文龙密报城内情况，毛文龙当机立断，派千总陈忠率一百余名士兵乘夜渡过鸭绿江，与早已被策反的镇江中军陈良策里应外合。
二更时分，明军突然发难，后金守军猝不及防，佟养真父子及部下六十余人被生擒，镇江堡成功收复，史称“镇江大捷”。
镇江大捷的消息传开后，“远近震动”，辽东东部山区及南四卫（金州、复州、盖州、海州）民众纷纷响应，汤站、险山二堡民众甚至自行绑缚后金守将陈九阶、李世科，献给毛文龙。
毛文龙在镇江收编辽民四万余人，组建军队万人（其中包含原明军八百人），敌后抗金声势一度高涨。